اولین دستگاه کروماتوگرافی بین سالهای 1970 تا 1980 توسط کمپانی Waters معرفی شد. کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (High- performance liquid chromatography:HPLC) یک تکنیک تحلیلی قدرتمند است که کاربردهای مختلفی دارد. این تکنیک از فشار بالا برای عبور مایعات از طریق ستون استفاده مینماید تا جداسازی مؤثرتر و سریعتری در مورد اجزاء مخلوط انجام شود. HPLC میتواند برای تحلیل نمونههای متنوعی مانند داروها، مایعات زیستی و نمونههای محیطی استفاده شود. همچنین برای تعیین خلوص، غلظت، نظارت بر پیشرفت واکنشهای شیمیایی و شناسایی آلودگیهای نمونه نیز قابل استفاده است.
کاربردهای HPLC
- جداسازی و شناسایی ترکیبات آلی در نمونههای مجهول
- اندازهگیری فاکتورهای خونی مانند آمینواسیدها به منظور تشخیص بیماریهای متابولیک همچون هموسیستونوری و فنیل کتنوری
- جداسازی، خالصسازی و شناسایی اسیدهای نوکلئیک، هیدروکربنها، داروها، ترپنوئیدها، حشرهکشها، آنتیبیوتیکها و استروئیدها
- برخی از آزمایشهای مرتبط با تعیین غلظت داروها
متد HPLC
اساس کار کروماتوگرافی جداسازی مخلوطها بر پایه توزیع اجزاء آنها بین دو فاز ثابت (ساکن) و متحرک میباشد. HPLC بر اساس قطبیت فاز ثابت به دو دسته فاز نرمال و فاز معکوس گروهبندی شده و بر طبق مکانیسمهای جداسازی به انواع جذب سطحی، تعویض یون و طرد اندازه (Size exclusion chromatography) تقسیمبندی میشود. متد HPLC شامل عبور نمونه از طریق یک ستون فاز ثابت است. اجزاء نمونه با فاز ثابت به شکلهای متفاوتی تعامل داشته و در زمانهای مختلف از ستون خارج میگردند. اجزاء خارج شده با استفاده از انواع خاصی از آشکارسازها (دتکتورها)، بررسی و اندازهگیری خواهند شد. پیش از انجام یک تحلیل HPLC، ضروری است که تجهیزات به درستی نگهداری شده و ستون تمیز و بدون آلودگی باشد.
اجزاء دستگاه HPLC
- مخزن حلال (HPLC Solvent) : حلال باید بسیار خالص بوده که بدین منظور از فیلترهای مخصوصی عبور داده میشود. همچنین، باید گاز زدایی شده باشد تا حبابهای گاز، در سیستم آشکارساز اختلال ایجاد نکنند. از متداولترین حلالها میتوان به متانول اشاره نمود.
- پمپ (Pump) :استفاده از پمپها به منظور عبور فاز متحرک به همراه نمونه با سرعت و جریان ثابت از میان فاز ساکن میباشد.
- سیستم تزریق (Injector) : تزریق نمونه در Loop صورت میگیردزیرا فشار دستگاه بالا است.
- ستون (Column) : ترکیبات بر اساس قطبیت خود، در ستون جداسازی میشوند و هر کدام یک نوار را در ستون تشکیل میدهند.
- آشکارساز (Detector) : نمونه بعد از جداسازی در ستون وارد آشکارساز شده و با دریافت هر جزء از اجزای نمونه یک سیگنال الکتریکی تولید میکند.
مراحل HPLC
- ورود نمونه به دستگاه : توسط سرنگ یا به صورت اتوماتیک انجام میشود.
- ورود فاز متحرک : نمونه برای این که در دستگاه حرکت کند، نیاز به ترکیبشدن با یک یا چند حلال دارد. این فاز متحرک توسط پمپ دستگاه با یک سرعت و جریان ثابت وارد میشود.
- ورود مایع به داخل ستون : در دستگاه، موانعی داخل ستون قرار دارد که به آنها، فاز ساکن گفته میشود، تا هنگام عبور نمونه از داخل ستون، بر اثر برخورد نمونه با این فاز، ترکیبهای مختلف از هم تفکیک شوند.
- تشخیص و بررسی : هنگامی که نمونه از ستون خارج میشود، وارد یک آشکارساز شده، و متناسب با هر ترکیب، یک سیگنال مرتبط با آن ارسال میشود. آشکارسازهای متفاوتی در دستگاه HPLC به کار برده میشوند که شامل فرابنفش-مرئی (UV-Vis)، فلورسانس (Fluorescence) و طیفسنج جرمی (MS) هستند.
مزایا و محدودیتها
مزایا
- دقت و حساسیت بالا
- قابلیت آنالیز نمونههای غیرفرار و حساس به دما
- برای نمونههایی با حجم بالا مناسب است.
- در این سیستم دو فاز ثابت و متحرک با مکانیسم رقابتی عمل کرده که منجر به انجام آنالیزهای دقیق میشوند.
- قابلیت مقایسه ساختار پروتئینهای مختلف
- هرگونه ناخالصی با قطبیتهای مختلف، قابل تشخیص است.
- وجود آب در نمونههای آزمایشی مشکلی در طی آنالیز ایجاد نمیکند.
- دارای سهولت تجدیدپذیری (Reproducibility)است.
محدودیتها
- فشار بالا لازم برای عبور مایع از ستون میتواند تجهیزات را تخریب کند و فاز ثابت ممکن است با گذشت زمان مسدود شود.
- HPLC نسبت به سایر تکنیکهای تحلیلی گرانتر است.
- نیاز به تجهیزات خاص دارد.
نتیجهگیری
در یک نگاه کلی، میتوان گفت که HPLCیک تکنیک تحلیلی قدرتمند با کاربردهای گسترده است. دقت و حساسیت این تکنیک، آن را برای تحلیل مخلوطهای پیچیده مناسب میکند و قابلیت خودکار شدن آن برای نمونههایی با حجم بالا بسیار مناسب است. اما باید از محدودیتهای HPLC نیز آگاه بود و تجهیزات را به درستی آماده کرده تا نتایج دقیق و قابل اعتمادی حاصل شود.
سخن پایانی
آزمایشگاه پویش، با برخورداری از آخرین تجهیزات آزمایشگاهی و تیم تخصصی مجرب، آماده ارائه خدمات با بالاترین دقت و کیفیت به مراجعان گرامی در زمینه موارد زیر خواهد بود.
